文献精读

再帕尔·阿不力孜科研团队第25期

中国医学科学院药物研究所

天然药物活性物质与功能国家重点实验室

文献整理：李江硕指导教师：徐婧

年4月，来自西北大学生命科学与医学部赵英永教授团队在顶尖学术期刊《NatureCommunications》发表了一篇题为“Identificationofserummetabolitesassociatingwithchronickidneydiseaseprogressionandanti-fibroticeffectof5-methoxytryptophan”的研究论文。研究者通过对例慢性肾病不同进展期患者和健康志愿者的血清开展代谢组学研究，结合生物信息学、药理学等分析方法鉴定了5个和慢性肾病进展密切相关的生物标志物，发现五苓散等药物干预对5个生物标志物具有显著恢复作用。进一步地，通过动物模型和细胞模型实验证明了5-甲氧基色氨酸(5-MTP)对慢性肾病引起的炎症和纤维化具有改善作用，并发现5-MTP合成的关键酶TPH-1是慢性肾病的潜在治疗靶点，为慢性肾病的治疗提供了新的分子理论基础。

背景介绍

慢性肾病又称慢性肾功能不全或慢性肾衰竭，简称CKD，指肾功能在几个月或若干年期间难以逆转的衰退。临床上患者主要表现为浮肿、蛋白尿、血尿、高血压等。CKD的早期诊断主要通过血肌酐、尿微量白蛋白、尿素氮肌酐比、肾小球滤过率估值(eGFR)等生化指标定量分析获得。然而使用血肌酐估算eGFR易受肌肉比例、年龄等非疾病因素影响，此外，尿蛋白会受发烧、感染等其他疾病影响，肾损伤恢复后，尿蛋白含量水平仍可能居高不下。仅通过生化指标进行CKD诊断会存在一定的假阳性率，因此，临床上迫切需要更好地评估肾功能的小分子标志物用以CKD的早期诊断。

实验设计

图1.实验设计流程图

本研究共纳入受试者例，其中训练集例，外部验证集90例，纵向队列验证集例，药物治疗验证集例。收集受试者的血清，采用UPLC-HRMS针对训练集的样本开展非靶向代谢组学分析，采用UPLC-MS/MS针对外部验证的样本开展靶向代谢组学分析。分别通过细胞模型和动物模型实验对发现的生物标志物进行生物学功能验证，对单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠进行5-MTP腹腔注射一周，证明5-MTP的抗炎和抗纤维化作用，并利用UUO和肾缺血再灌注损伤(IRI)小鼠研究TPH-1的表达(图1)。

实验结果

1.慢性肾病生物标志物的发现与鉴定

对训练集中个血清样本采用UPLC-HRMS开展代谢组学研究，共检测到个变量，包括正离子个变量和负离子个变量，基于LASSO回归进行差异变量筛选，正离子和负离子扫描模式下分别得到58个和66个差异变量。基于MSE扫描模式，根据其二级质谱信息和数据库检索，分别鉴定了39个和59个差异代谢物。为了进一步测试98个代谢物的分类能力，采用随机森林和支持向量机分类方法建模，随机森林模型诊断准确率为98.4%，支持向量机模型诊断准确率99%。代谢通路分析表明98个差异代谢物主要涉及FXR受体激活，天冬氨酸合成和降解，谷氨酸降解，乙酰辅酶A生物合成，精胺和亚精胺降解，鸟苷酸降解，血清素和褪黑素生物合成，羟丁赖氨酸生物合成等通路(图2)。

图2.通路富集分析

对差异代谢物进行进一步筛选，发现5个与疾病进展密切相关的生物标志物：5-甲氧基色氨酸、刀豆氨酸琥珀酸、甲基巴豆酰肉碱和牛磺酸显著下调，乙酰肉碱显著上调，其均可对CKD不同的进展阶段进行区分(图3.a-e)。此外，临床生化指标中尿素和尿蛋白在CKD患者中显著上调(图3.g-h)。

图3.生物标志物在CKD不同进展期中的变化趋势

无监督的聚类热图分析表明这5个代谢物可以区分健康和CKD不同阶段(图4.a)。其在有监督的随机森林模型分类准确度达95.5%，支持向量机模型分类准确度达92%(图4.b-d)。ROC曲线表明由这5个代谢物和尿蛋白组成的标志物组AUC值达0.(图4.e)，表明这5个代谢物可以显著区分健康人和CKD患者，有望应用于CKD的临床诊断。

图4.a.5个生物标志物在训练集中的无监督聚类热图分析；b.不同分类模型的诊断准确率；c.随机森林模型的诊断准确率；d.支持向量机模型的诊断准确率；e.组合标志物的ROC曲线分析；f.5个生物标志物在外部验证集中的无监督聚类热图分析；g.外部验证集的主成分分析；h.外部验证集的随机森林模型诊断准确率；i.外部验证集的支持向量机模型诊断准确率

2.5个生物标志物的外部验证

外部验证样本由30例CKD1、30例CKD2和30例健康人组成，主要考察标志物对CKD的早诊能力。采用无监督的聚类热图分析、主成分分析和有监督的随机森林和支持向量机模型，均可对验证集的样本进行准确分组(图4.f-i)。外部验证结果表明这5个代谢物具有较强的诊断能力。

3.5个标志物的纵向队列验证

进一步地，在一项前瞻性纵向队列研究中，例受试者在随访进程中有31例受试者发展成为CKD患者。通过UPLC-MS/MS靶向代谢组学对31例受试者患病前后的血清样本中5个代谢物进行检测分析。图5.a-b展示了31例受试者在患病前后代谢物的丰度变化，其变化趋势与训练集一致。PCA，OPLS-DA和无监督聚类热图分析表明这五个代谢物可以对31个患者患病前后进行区分(图5.c-e)。此外，ROC分析表明这5个代谢物AUC值均大于0.75，具有较强的诊断能力(图5.g)。

图5.a.标志物在受试者患病前后变化趋势散点图；b.标志物在受试者患病前后变化趋势线图；c.受试者患病前后PCA分析得分图；d.受试者患病前后OPLS-DA分析得分图；e.受试者患病前后标志物聚类分析热图；f.PLS-DA模型的诊断准确性；g.标志物的ROC曲线分析

4.通过药物治疗干预对5种标志物进行靶向验证

药物治疗验证组共有CKD2受试者例，分别为依那普利治疗组40例，泼尼松治疗组38例，五苓散治疗组36例。通过UPLC-MS/MS靶向代谢组对CKD经药物治疗前后患者体内这5个代谢物的丰度变化进行检测分析。结果表明，在用药后，患者的尿蛋白水平显著降低，表明药物对病情有所改善，5个代谢物的丰度均显著恢复。PCA，OPLS-DA和聚类热图分析表明患者治疗前与治疗后呈显著分组趋势。图6.a-b中展示的即为5个代谢物在依那普利治疗前后患者血清中的变化情况，5个代谢物表现出的丰度变化方向均和训练集一致。通过将蛋白尿和5个代谢物结合(图6.c-e)，其诊断灵敏度和特异性分别达到90%和80%(图6.f)；仅通过5个代谢物组合也可得到相似的结果(图6.g-j)。ROC分析表明五个代谢物和蛋白尿的AUC值均较高，诊断能力较强(图6.k)。

图6.a.标志物在患者治疗前后变化趋势散点图；b.标志物在患者治疗前后变化趋势线图；c.患者治疗前后PCA分析得分图(尿蛋白和五个标志物)；d.患者治疗前后OPLS-DA得分图(尿蛋白和五个标志物)；e.患者治疗前后标志物聚类分析热图(尿蛋白和五个标志物)；f.PLS-DA模型的诊断准确性(尿蛋白和五个标志物)；g.患者治疗前后PCA分析得分图(五个标志物)；h.患者治疗前后OPLS-DA得分图(五个标志物)；i.患者治疗前后标志物聚类分析热图(五个标志物)；j.PLS-DA模型的诊断准确性(五个标志物)；k.标志物的ROC曲线分析

5.5-甲氧基色氨酸(5-MTP)的肾脏保护作用

5个生物标志物中，5-MTP是与eGFR较为显著相关的代谢物，前期研究表明5-MTP具有血管损伤保护作用和抗炎作用，但是在肾损伤动物模型和肾小管上皮细胞中尚未证实。因此，研究者分别开展了体内体外实验对5-MTP的肾脏保护作用进行研究。首先，为了确认5-MTP的组织特异性，研究者对不同组织中5-MTP的含量水平进行检测。结果表明在单侧输尿管梗阻小鼠(UUO)中，5-MTP在肾脏中显著降低(图7.a)，而其他组织中未发生显著变化。然后，对UUO小鼠腹腔注射5-MTP(给药剂量10mg/kg和mg/kg，连续给药一周)，收集小鼠肾组织进行免疫学分析，用以证明5-MTP的抗炎和抗纤维化作用。UUO小鼠在给予5-MTP后，HE染色和Masson染色表明肾脏炎症和纤维化减弱(图7.b)。WesternBlot实验表明，给予5-MTP后，Nrf2、HO1、NQO-1，IκBα表达增加，p-IκBα、NF-κBP65、MCP-1和COX-2表达减少，表明5-MTP对UUO模型小鼠具有较强的抗炎作用(图7.c-d)。肾间质中CD3+和CD68+细胞的数量也发生了显著降低(图7.e-f)。同样地，免疫组化结果表明，5-MTP处理后,肾间质纤连蛋白、波形蛋白、促纤维化蛋白I、纤连蛋白、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等与肾脏纤维化相关的蛋白表达减弱(图7.g-i)。

图7.a.UUO小鼠中不同组织5-MTP的含量；b.UUO小鼠肾组织的HE染色和Masson染色；c.d.与炎症因子等有关的蛋白表达变化；e.f.CD3+和CD68+的免疫组化结果和相对含量比较；g.纤连蛋白和波形蛋白的免疫组化结果；h.i.与肾脏纤维化有关的蛋白表达变化

此外，研究者评估了5-MTP的体外抗炎和抗纤维化的作用。5-MTP处理HK-2细胞和HMC细胞后，显著抑制了炎症标志物IκBα,p-IκBα,NF-κBp65，MCP-1和COX-2的表达，恢复了细胞保护通路Nrf2,HO-1和NQO-1的表达。并且，高浓度的5-MTP显示出更强的抗炎活性(图8.a-f)。WesternBlot分析和免疫荧光染色表明5-MTP减少了炎症介质NF-κBp65,MCP-1和COX-2的表达，而细胞保护性抗炎转录因子Nrf2及其靶基因产物HO-1和NQO-1的表达有所增加。5-MTP的治疗显著抑制了促纤维化蛋白I、纤连蛋白、波形蛋白、α-SMA的上调(图8.g.h)。免疫荧光染色表明5-MTP减弱了HK-2细胞中波形蛋白的表达(图8.i)。以上实验均证明5-MTP在体外和体内发挥强烈的抗炎和抗纤维化作用。

图8.a.b.HK-2细胞与炎症因子等有关的蛋白表达变化；c.HK-2细胞NF-κBp65免疫荧光染色图；d.e.HMC细胞与炎症因子等有关的蛋白表达变化；f.HMC细胞COX-2和HO-1免疫荧光染色图；g.h.HK-2细胞与肾纤维化有关的蛋白表达变化；i.HK-2细胞波形蛋白免疫荧光染色图

6.TPH-1对肾病的保护作用

色氨酸羟化酶TPH-1是5-MTP合成的关键酶，敲除TPH-1会导致血清中5-MTP的下调。由TGF-β1和LPS刺激引起的肾损伤导致TPH-1表达降低(图9.a)。敲降TPH-1抑制上皮细胞标志物的表达并增加促纤维化标志物的表达(图9.b-d)。作者进一步研究了TPU-1在UUO和IRI小鼠中的表达情况，发现模型小鼠中TPH-1表达均显著下调(图9.e)。TPH-1过表达会导致小鼠中5-MTP的显著上调(图9.f.g)。TPH-1过表达的UUO小鼠促炎和促纤维化标志物的表达降低(图9.h-k)。相反，TPH-1缺乏则加剧了UUO小鼠的炎症和纤维化(图9.l-o)。以上结果表明TPH-1可能是CKD的潜在治疗靶点。

总结

本研究通过大队列人群的代谢组学研究和多步验证实验，发现了5-甲氧基色氨酸、刀豆氨酸琥珀酸、乙酰肉碱、甲基巴豆酰肉碱和牛磺酸这5个与慢性肾病进展密切相关的生物标志物。此外，作者通过体内体外实验对5-MTP及其合成的关键酶色氨酸羟化酶-1(TPH-1)进行了生物学功能研究，发现5-MTP对慢性肾病引起的炎症和纤维化具有改善作用，TPH-1高表达会引起5-MTP上调，进一步抑制NF-κB通路，激活Nrf2通路来发挥肾保护作用，进一步证明了TPH-1是CKD的潜在治疗靶标，为慢性肾病的治疗提供了新的分子理论依据。

参考文献

ChenDQ,CaoG,ChenH,etal.Identificationofserummetabolitesassociatingwithchronickidneydiseaseprogressionandanti-fibroticeffectof5-methoxytryptophan[J].NatureCommunications,,10:.

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